结构生物学

引言 RNA不只是DNA和蛋白质之间的“信使”——它能折叠成复杂的功能结构。从tRNA、核糖体RNA到核糖开关，我们早已知道RNA结构的重要性，但直到高通量测序技术的出现，我们才真正意识到：RNA结构无处不在，存在于每一种生物的每一条RNA上。 这篇综述（Cao等，2024，Nature Reviews Molecular Cell Biology）系统性地总结了过去十年RNA结构研究的技术进展、RNA结构在基因调控中的作用，以及如何靶向RNA结构进行药物设计。 一、研究RNA结构的技术进展 1. 传统方法的局限 早期研究RNA结构主要依赖生物物理技术： X射线晶体学：分辨率高，但需要结晶，适合短RNA NMR：可溶液中研究，但分子量受限 冷冻电镜（cryo-EM）：近年来突破很大，但仍有挑战 生化方法包括： 核酸酶酶切：RNase T1/S1（单链）、RNase V1（双链） 化学修饰：DMS（修饰A/C）、SHAPE（修饰2’-OH） 但这些方法通常只能研究单个RNA，且电泳检测耗时耗力，不适合全转录组规模。 2. 高通量测序时代 2010年以来，高通量测序彻底改变了这个领域： 化学探针法（Chemical Probing） 原理：化学修饰后，逆转录酶会在修饰位点停滞或引入突变，通过测序定位 常用试剂： DMS：体内外都可用，修饰A/C SHAPE（NAI、2A3）：修饰所有4种碱基的柔性2’-OH 检测方式： RT-stall：逆转录停滞，测截断位点 MaP（Mutational Profiling）：突变谱，更准确 邻近连接法（Proximity Ligation） 原理：交联后将相互作用的RNA片段连接在一起，测序鉴定 方法： PARIS、SPLASH、LIGR-seq、COMRADES：基于补骨脂素交联，捕获直接碱基配对 CLASH、hiCLIP、CRIC-seq、RIC-seq：基于蛋白-RNA交联，捕获蛋白介导的相互作用 优势：能鉴定长程的分子内或分子间相互作用 新技术方向 单细胞、单分子：smStructure-seq、Nano-DMS-MaP 纳米孔直接测序：避免逆转录偏差 AI辅助：结合深度学习预测结构 3. 计算工具 结构预测：RNAfold、CONTRAfold、EternaFold 数据处理：从测序reads推断化学 reactivity 构象解析：RING-MaP、DREEM、DANCE-MaP、DRACO（从混合群体中解构不同构象） AI方法：SPOT-RNA、MXfold2、Ufold、DRfold、trRosettaRNA、ARES 二、RNA结构在基因调控中的作用 1. 转录调控 原核生物： 核糖开关（Riboswitch）：感受代谢物，通过结构变化控制转录终止 转录暂停为核糖开关折叠提供时间窗口 真核生物： 转录速度影响共转录折叠：慢Pol II导致更紧凑的结构，影响剪接和编辑 lncRNA结构：7SK的构象转换控制P-TEFb活性；COOLAIR结构响应温度调控FLC（开花） 2. RNA剪接 局部结构：5’剪接位点前两个核苷酸保持未配对对识别很重要 长程配对： 果蝇Dscam基因通过竞争性RNA配对实现互斥剪接 哺乳动物中RBFOX蛋白通过远端RNA配对调控剪接 反向剪接产生circRNA也依赖Alu重复序列配对 3. 翻译调控 5’ UTR结构： 热力学稳定结构阻碍扫描 RNA温度计：高温熔解，暴露RBS（如李斯特菌毒力基因） 铁响应元件（IRE）：结合铁调节蛋白 uORF附近的发夹动态调控起始密码子选择 G-四链体（rG4）： 5’ UTR的rG4抑制翻译，需要解旋酶（如DHX36） 植物中JUL蛋白结合rG4调控韧皮部发育 IRES：病毒和部分细胞mRNA的帽非依赖翻译 CDS结构：起始密码子下游约70nt的高度折叠结构需要解旋酶（Dhh1/DDX6） 3’ UTR结构：rG4也能抑制翻译；RBP结合促进5’-3’通讯 4. RNA降解 3’ UTR整体结构化：通常与稳定性正相关 结构动态：斑马鱼母源-合子转换（MZT）期间，3’ UTR结构重塑，控制Elavl1a结合，决定mRNA命运 蛋白识别：AUF1、HuR识别单链ARE；STAU1、regnase 1、roquin识别双链或茎环 5. RNA定位 RNA zipcode：定义结构被RBP识别，沿细胞骨架运输 酵母ASH1：茎环结构决定子细胞定位 果蝇bicoid、oskar等：母体mRNA的不对称定位 哺乳动物ACTB：3’ UTR zipcode决定成纤维细胞前缘定位 植物长距离运输：tRNA样结构促进mRNA通过韧皮部 systemic movement 病毒RNA：HIV RRE、逆转录病毒CTE介导核输出 6. RNA结构依赖的凝聚体 RNA-RNA相互作用： 酵母应激颗粒富含反义RNA-mRNA配对 环-环碱基配对驱动RNA多聚化 GGGGCC重复（ALS/FTD）形成分子间rG4诱导凝聚 植物SHR mRNA的rG4触发内皮层细胞凝聚 RNA-蛋白相分离： 单链RNA促进polyQ蛋白Whi3凝聚 SARS-CoV-2基因组双链RNA促进N蛋白凝聚 NEAT1作为架构形成paraspeckles rG4和i-motif与组蛋白H1形成液滴 三、靶向RNA结构的药物开发 曾几何时，RNA被认为是“不可成药”的——缺乏特异性的“药袋”。但现在情况变了。 ...