引言

RNA不只是DNA和蛋白质之间的“信使”——它能折叠成复杂的功能结构。从tRNA、核糖体RNA到核糖开关，我们早已知道RNA结构的重要性，但直到高通量测序技术的出现，我们才真正意识到：RNA结构无处不在，存在于每一种生物的每一条RNA上。

这篇综述（Cao等，2024，Nature Reviews Molecular Cell Biology）系统性地总结了过去十年RNA结构研究的技术进展、RNA结构在基因调控中的作用，以及如何靶向RNA结构进行药物设计。

一、研究RNA结构的技术进展

1. 传统方法的局限

早期研究RNA结构主要依赖生物物理技术：

  • X射线晶体学：分辨率高，但需要结晶，适合短RNA
  • NMR：可溶液中研究，但分子量受限
  • 冷冻电镜（cryo-EM）：近年来突破很大，但仍有挑战

生化方法包括：

  • 核酸酶酶切：RNase T1/S1（单链）、RNase V1（双链）
  • 化学修饰：DMS（修饰A/C）、SHAPE（修饰2’-OH）

但这些方法通常只能研究单个RNA，且电泳检测耗时耗力，不适合全转录组规模。

2. 高通量测序时代

2010年以来，高通量测序彻底改变了这个领域：

化学探针法（Chemical Probing）

  • 原理：化学修饰后，逆转录酶会在修饰位点停滞或引入突变，通过测序定位
  • 常用试剂：
    • DMS：体内外都可用，修饰A/C
    • SHAPE（NAI、2A3）：修饰所有4种碱基的柔性2’-OH
  • 检测方式：
    • RT-stall：逆转录停滞，测截断位点
    • MaP（Mutational Profiling）：突变谱，更准确

邻近连接法（Proximity Ligation）

  • 原理：交联后将相互作用的RNA片段连接在一起，测序鉴定
  • 方法：
    • PARIS、SPLASH、LIGR-seq、COMRADES：基于补骨脂素交联，捕获直接碱基配对
    • CLASH、hiCLIP、CRIC-seq、RIC-seq：基于蛋白-RNA交联，捕获蛋白介导的相互作用
  • 优势：能鉴定长程的分子内或分子间相互作用

新技术方向

  • 单细胞、单分子：smStructure-seq、Nano-DMS-MaP
  • 纳米孔直接测序：避免逆转录偏差
  • AI辅助：结合深度学习预测结构

3. 计算工具

  • 结构预测：RNAfold、CONTRAfold、EternaFold
  • 数据处理：从测序reads推断化学 reactivity
  • 构象解析：RING-MaP、DREEM、DANCE-MaP、DRACO（从混合群体中解构不同构象）
  • AI方法：SPOT-RNA、MXfold2、Ufold、DRfold、trRosettaRNA、ARES

二、RNA结构在基因调控中的作用

1. 转录调控

  • 原核生物：
    • 核糖开关（Riboswitch）：感受代谢物，通过结构变化控制转录终止
    • 转录暂停为核糖开关折叠提供时间窗口
  • 真核生物：
    • 转录速度影响共转录折叠：慢Pol II导致更紧凑的结构，影响剪接和编辑
    • lncRNA结构：7SK的构象转换控制P-TEFb活性；COOLAIR结构响应温度调控FLC（开花）

2. RNA剪接

  • 局部结构：5’剪接位点前两个核苷酸保持未配对对识别很重要
  • 长程配对：
    • 果蝇Dscam基因通过竞争性RNA配对实现互斥剪接
    • 哺乳动物中RBFOX蛋白通过远端RNA配对调控剪接
    • 反向剪接产生circRNA也依赖Alu重复序列配对

3. 翻译调控

  • 5’ UTR结构：
    • 热力学稳定结构阻碍扫描
    • RNA温度计：高温熔解，暴露RBS（如李斯特菌毒力基因）
    • 铁响应元件（IRE）：结合铁调节蛋白
    • uORF附近的发夹动态调控起始密码子选择
  • G-四链体（rG4）：
    • 5’ UTR的rG4抑制翻译，需要解旋酶（如DHX36）
    • 植物中JUL蛋白结合rG4调控韧皮部发育
  • IRES：病毒和部分细胞mRNA的帽非依赖翻译
  • CDS结构：起始密码子下游约70nt的高度折叠结构需要解旋酶（Dhh1/DDX6）
  • 3’ UTR结构：rG4也能抑制翻译；RBP结合促进5’-3’通讯

4. RNA降解

  • 3’ UTR整体结构化：通常与稳定性正相关
  • 结构动态：斑马鱼母源-合子转换（MZT）期间，3’ UTR结构重塑，控制Elavl1a结合，决定mRNA命运
  • 蛋白识别：AUF1、HuR识别单链ARE；STAU1、regnase 1、roquin识别双链或茎环

5. RNA定位

  • RNA zipcode：定义结构被RBP识别，沿细胞骨架运输
    • 酵母ASH1：茎环结构决定子细胞定位
    • 果蝇bicoid、oskar等：母体mRNA的不对称定位
    • 哺乳动物ACTB：3’ UTR zipcode决定成纤维细胞前缘定位
  • 植物长距离运输：tRNA样结构促进mRNA通过韧皮部 systemic movement
  • 病毒RNA：HIV RRE、逆转录病毒CTE介导核输出

6. RNA结构依赖的凝聚体

  • RNA-RNA相互作用：
    • 酵母应激颗粒富含反义RNA-mRNA配对
    • 环-环碱基配对驱动RNA多聚化
    • GGGGCC重复（ALS/FTD）形成分子间rG4诱导凝聚
    • 植物SHR mRNA的rG4触发内皮层细胞凝聚
  • RNA-蛋白相分离：
    • 单链RNA促进polyQ蛋白Whi3凝聚
    • SARS-CoV-2基因组双链RNA促进N蛋白凝聚
    • NEAT1作为架构形成paraspeckles
    • rG4和i-motif与组蛋白H1形成液滴

三、靶向RNA结构的药物开发

曾几何时，RNA被认为是“不可成药”的——缺乏特异性的“药袋”。但现在情况变了。

1. 靶点选择

理想靶点：复杂、稳定、功能性、特异性。

  • 病原体RNA：
    • HIV TAR、RRE：抑制病毒复制
    • 细菌FMN核糖开关：5FDQD选择性抑制艰难梭菌，不影响肠道菌群
  • 人类RNA：
    • NRAS 5’ UTR G-四链体：抑制癌基因翻译
    • Xist lncRNA RepA元件：Xist靶向

2. 成功案例：Risdiplam

  • 适应症：脊髓性肌萎缩症（SMA）
  • 靶点：SMN2前mRNA-蛋白复合物
  • 机制：稳定弱剪接位点处的剪接机器，增加功能性SMN2异构体
  • 优势：高选择性，脱靶剪接效应少

3. 其他策略

  • 靶向pre-miRNA：结合Dicer加工位点附近的二级结构，抑制成熟
  • 模块化组装：两个小分子连接，提高相邻结构的结合特异性
  • RNA降解剂：结合模块+RNA切割模块（博来霉素）或招募内源性RNase（如RNase L）

四、总结与展望

过去十年，我们在RNA结构鉴定上取得了巨大进步，但仍有很多未知：

  • 单细胞、单分子水平的结构动态
  • 细胞内RNA三级结构如何折叠执行功能
  • 如何更精准地设计小分子靶向RNA结构

随着技术和算法的发展，未来十年有望：

  1. 获得更多单分子和单细胞的结构动态数据
  2. 深入理解RNA三级结构在细胞内的折叠和功能
  3. 更好地设计高特异性、高亲和力的小分子靶向RNA结构
  4. 结合AI，破译结构-功能的规则，用于RNA工程（疫苗、药物）

参考：Cao, X., Zhang, Y., Ding, Y., & Wan, Y. (2024). Identification of RNA structures and their roles in RNA functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 25, 784–801.