长读长测序

概述 DNA甲基化（主要是CpG位点的5mC）是关键的表观遗传修饰，在基因调控、基因组印记、X染色体失活、转座子沉默等过程中发挥核心作用。传统的短读长亚硫酸氢盐测序（BS-seq）虽然能高精度检测甲基化，但读长短（通常<300bp），无法解决重复序列区域、单倍型特异性甲基化、结构变异与甲基化的关联等问题。 长读长测序技术（PacBio HiFi、Oxford Nanopore）的兴起，结合不依赖亚硫酸氢盐的甲基化检测方法，正在彻底改变这一领域。这篇Fu、Timp与Sedlazeck（2025，Nature Reviews Genetics）的综述，系统性总结了长读长测序在DNA甲基化研究中的技术进展、计算方法、应用场景与未来方向。 一、长读长甲基化检测技术 1. 两大技术平台的原理 Oxford Nanopore（纳米孔） 原理：DNA分子通过纳米孔时，不同碱基（包括甲基化修饰的碱基）会产生不同的电流信号，通过机器学习模型从电流信号中直接推断甲基化状态 优势： 读长极长（可达Mb级别），适合跨越重复序列和大型SV 直接测序，无需PCR扩增，保留原始修饰信息 实时测序，可快速获得结果 常用工具： Guppy、Dorado（ONT官方碱基与修饰识别） Megalodon（旧版本，已被Dorado替代） Remora（高性能修饰识别模型） DeepSignal、DeepMod、Nanopolish等第三方工具 PacBio HiFi（SMRT测序） 原理：通过测序过程中聚合酶的动力学特征（脉冲宽度、脉冲间隔等）来推断甲基化状态 优势： 高准确度（HiFi读长准确度>99.9%），适合同时检测遗传变异与甲基化 读长适中（10-25kb），平衡了覆盖度与连续性 常用工具： pb-CpG-tools（PacBio官方工具） Primrose、DeepCpG等 2. 与传统方法的对比 特性 短读长BS-seq Nanopore甲基化 PacBio HiFi甲基化 读长 <300bp kb-Mb级 10-25kb 单倍型解析能力 差（需借助基因型） 优（直接通过长读长） 优（HiFi准确度高） 重复序列区域覆盖 差 优 中-优 成本 低 中-高 高 计算资源需求 低 中-高 中 二、计算分析流程与工具 1. 基础流程：从原始信号到甲基化位点 纳米孔数据处理 原 始 f a s t 5 信 号 → D o r a d o / G u p p y 碱 基 识 别 + 修 饰 检 测 → 甲 基 化 调 用 （ b e d M e t h y l 格 式 ） → 质 量 过 滤 与 归 一 化 关键步骤： 修饰检测：使用针对5mC（CpG）训练的模型，ONT提供多种预训练模型 格式转换：从ModBAM到bedMethyl、bigWig等常用格式 归一化：处理不同测序运行间的批次效应 PacBio HiFi数据处理 H i F i r e a d s → p b - C p G - t o o l s 甲 基 化 检 测 → 与 基 因 组 比 对 → 甲 基 化 水 平 定 量 2. 单倍型特异性甲基化（Haplotype-specific methylation） 长读长的核心优势之一是可以直接将甲基化状态与单倍型关联，无需复杂的基因型推断。 ...